由于大腸菌群在形態和生理上較為接近，因此，在某些必要情況下，只能借助生化檢驗來區別它們。通常以吲哚試驗，甲基紅試驗、V.P反應及檸檬酸鈉利用等四項檢驗(通稱為IMViC試驗)來鑒定大腸菌群(表7.6)。

　　大腸菌群雖然被認為是比較理想的糞便污染指示菌，但仍有不足之處，如對氯的抵抗力弱于某些腸道病毒，在水中可繁殖等。以大腸菌群作為水質指標，只能反映水體被糞便污染的程度，間接反映出水中有腸道病原菌存在的可能性，但不能反應水中是否有傳染性病毒以及除腸道病原菌以外的其他病原菌(如炭疽桿菌等)。因此必要時，需對水樣作病原體檢驗。

　　在土壤、水等自然環境和植物體內也能分離出大腸菌群的某些菌屬，如克雷伯氏菌屬、檸檬酸桿菌屬、腸桿菌屬和歐文氏菌屬等。這些大腸菌群細菌雖然不能代表來自糞便中的大腸菌群，至少會影響判斷水源受糞便污染的準確性。為了區別原本存在于土壤等環境中與來源于人畜糞便中的大腸菌群，一般稱在37℃培養下能發酵乳糖產酸產氣的大腸菌群為總大腸菌群，能在44.5℃生長并發酵乳糖產酸產氣的大腸菌群為糞大腸菌群。一般認為，人糞便中的糞大腸菌群約占總大腸菌群數的94%。