SeeDB實現生物體樣本深層成像

　　今井猛博士等人開發了一種對于水溶性生物體組織的形態和組成在不破壞熒光蛋白以及熒光神經同位素的條件下,可快捷簡便地使大腦等生物體組織透明化的方法——SeeDB。SeeDB由水、果糖、還原劑構成。

　　SeeDB法是在使用共聚焦顯微鏡和雙光子激發顯微鏡下可深層成像的方法。可利用熒光蛋白和神經示蹤劑，實現對熒光神經回路的全貌闡明和定量分析等各種各樣的應用。

◆SeeDB protocol案例

　　SeeDB法，可用于脊椎動物的各種組織，下面以小鼠大腦為例進行介紹。

１．固定

①　將小鼠大腦在4%多聚甲醛/PBS，4℃下固定過夜。

②　樣本用PBS清洗三次（每次清洗10分鐘）

２．透明化處理

③　將樣品加入放有20 mL的SeeDB:20 w/v%果糖溶液的50 mL錐形瓶中。

　　在室溫下在旋轉器中旋轉4-8小時（約4 rpm）

　　在脆弱的樣本和薄片情況也可以用壓板式搖床（約17 rpm）

④　將樣本加入放有SeeDB:40 w/v%果糖溶液的50 mL錐形管中，室溫下旋轉4-8小時。

⑤　將樣本加入放有SeeDB:60 w/v%果糖溶液的50 mL錐形管中，室溫下旋轉4-8小時。

⑥　將樣本加入放有SeeDB:80 w/v%果糖溶液的50 mL錐形管中，室溫下旋轉12小時。

⑦　將樣本加入放有SeeDB:100 w/v%果糖溶液的50 mL錐形管中，室溫下旋轉12小時。

⑧　將樣本加入放有SeeDB的50 mL錐形管中，室溫下旋轉24小時。

   　長時間可延長至48小時。在透明化成功時，透光可觀察到組織透明化。

３．觀察

⑨　將SeeDB處理過的大腦樣本置于共聚焦顯微鏡或雙光子激發顯微鏡下觀察。

（注意點）

　　樣本用SeeDB液固定。用SeeDB透明化處理后的樣本折射率可達到1.49。因此，物鏡中應該有甘油浸沒透鏡、油鏡、透明化用鏡片，即使浸水鏡頭到達2 mm深度也是沒有問題的。浸沒式鏡片請使用浸沒液，SeeDB不能用作浸沒液。在使用干式鏡頭（折射率1.0）和浸水鏡頭（折射率1.33）獲取畫像情況下，需要補正深度值（補正值請參考相關文獻）。

SeeDB　處理案例

SeeDB生物體樣本透明化

左起依次為經SeeDB液透明化處理的小鼠幼胎（幼胎12天）

新生鼠（生后3天）的全腦、成鼠大腦（8周齡，厚度2 毫米）

SeeDB　觀察案例

雙光子激發顯微鏡下的Thy1-YFP-H小鼠

（10周齡）大腦熒光成像

使用Olimpus公司產品

多光子物鏡：XLSLPLN25XGMP觀察案例

比例尺：100 微米

小鼠大腦固定后用Dil標記，SeeDB透明化處理案例   

左：嗅球僧帽細胞樹突（橫向觀察）

右：嗅球僧帽細胞樹突（縱向觀察）

使用Olympus公司產品

有機硅浸沒型物鏡：UPLSAPO 20X觀察案例。比例尺：100 微米。

SeeDB實現生物體樣本深層成像