蛋白層析柱的基本原理是將一份蛋白質混合物分成很多小份，從而使某些組分中目標蛋白的濃度通過濃縮得以增大。雖然已經有很多昂貴和特殊的設備可用于柱層析，但實際上它只需要基本的設備即可。
蛋白層析柱可以依賴用泵將溶劑以固定流速打入填裝好的層析柱的自動設備來完成或者依靠流動相的重力作用自己完成。自動系統或者重力柱系統均可與自動組分收集器連接使用。
蛋白層析柱的一般操作步驟如下：
裝柱、上樣、平衡、洗脫、收集、柱再生。
（1）樣品的選擇與預處理。
（2）裝柱。將層析柱垂直固定，一般是先在柱內裝入約1/3高度的水或緩沖液排走空氣。要求柱子裝的均勻，不分層，無氣泡。
（3）平衡。用3-5倍柱床體積的起始緩沖液走柱，使介質充分平衡，柱床穩定。
（4）上樣（加樣）。打開層析柱下端出口，使緩沖液流出至剛好達到柱面。沿柱壁緩慢加入樣品，打開下端出口，使樣品溶液流出至剛好達到柱面，再取少量起始緩沖液洗滌柱壁。加樣時應盡量減少柱面的攪動。
（5）洗脫與收集。打開起始緩沖液閥門，連續洗脫。用自動部分收集器自動或手動收集，合并同一高峰各管。流速不宜過快且要穩定，洗脫液的成分也不應改變（凝膠溶脹程度），整個洗脫過程中始終保持一定的操作壓，可以用水或緩沖液作洗脫液。
（6）再生與保存。用原始平衡液進行充分洗滌，即可重復使用。
