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概述

嵌合抗原受體（CAR）是經(jīng)過改造后賦予T細胞靶向特定抗原的新能力的受體蛋白。這些受體是嵌合的，因為它們將抗原結(jié)合和T細胞激活功能結(jié)合到一個受體中。CAR-T細胞療法使用經(jīng)過CAR改造的T細胞來治療癌癥。CAR-T免疫療法的前提是修改T細胞識別癌細胞，以便更有效地靶向和消滅它們。科學(xué)家從人體中獲取T細胞，對其進行基因改造，然后將產(chǎn)生的CAR-T細胞注入患者體內(nèi)以攻擊他們的腫瘤。

使用細胞計數(shù)儀監(jiān)控CAR-T細胞療法的生產(chǎn)

自2018年獲得FDA批準(zhǔn)以來，CAR-T療法已使血液惡性腫瘤患者的緩解率達到80%。與所有過繼細胞療法一樣，自體或同種異體CAR-T療法的生產(chǎn)是一個復(fù)雜的生物制造過程，需要嚴格遵守監(jiān)管和QA/QC指南。為了確保最終產(chǎn)品的安全性、質(zhì)量和功效，必須在整個開發(fā)和生物加工流程的過程中評估和監(jiān)控細胞的健康和活力。在此，我們演示了如何使用LUNA-FX7細胞計數(shù)儀來監(jiān)測和評估CAR-T過程中關(guān)鍵階段的細胞健康狀況：

（1）收集主要來源材料

（2）白細胞分離后

（3）分離/激活

（4）擴增

（5）生產(chǎn)

使用核酸染色劑吖啶橙和碘化丙啶（AO/PI）在熒光細胞計數(shù)模式下使用LUNA-FX7進行細胞計數(shù)。簡而言之，對于每次計數(shù)，將2 μl預(yù)混合AO/PI溶液與18μl細胞混合，裝入2、3或8通道載玻片中，并利用自動對焦功能進行計數(shù)。對于最終劑量測定，使用分析體積為5.1 μl（大多數(shù)自動化體積的10倍）的LUNA 1通道載玻片。

1、全血樣本的初始白細胞濃度和活力

在采血完成后和進行白細胞分離前，用1x PBS按1：100稀釋細胞，以便在LUNA-FX7中計數(shù)。盡管白細胞(WBC)僅占全血的2%，但如圖展示了如何輕松區(qū)分異質(zhì)群體中的有核細胞和無核細胞（紅細胞）。

明場(BF)、綠色通道(GF)和紅色通道(RF)的平鋪圖像(A)。標(biāo)記的(活/死有核細胞)圖像的疊加圖像(B、C)。1/100稀釋血液的白細胞總數(shù)和活力(D)

熒光細胞計數(shù)模式下CAR-T細胞的實驗方案參數(shù)設(shè)置

2、白細胞的分離

白細胞去除術(shù)是從全血中分離白細胞的過程。下圖顯示了2個不同樣品的活力。兩個樣本中均未發(fā)現(xiàn)紅細胞，但仍可觀察到一些細胞碎片。同樣，LUNA-FX7可以輕松區(qū)分細胞和細胞碎片，限度地減少誤報計數(shù)的可能性。

白細胞分離后的細胞濃度和活力。白細胞分離后的WBC樣本計數(shù)以及BF、GF和RF原始圖像(A)、FL標(biāo)記圖像和放大圖像(B、C)。評估兩個樣品并繪制細胞濃度和活力圖（D，E）

3、T細胞的分離和激活

白細胞分離后，T細胞被進一步分離并激活，產(chǎn)生同質(zhì)T細胞群。此階段，樣本質(zhì)量存在明顯對比。

分離和激活后對T細胞進行計數(shù)，以及BF、GF和RF原始圖像(A)、FL標(biāo)記圖像和放大圖像(B、C)。假陽性碎片可以通過最小細胞大小設(shè)置(D)來消除。評估兩個樣品并繪制細胞濃度和活力圖（E、F）

4、CAR表達的T細胞

分離并激活的 T 細胞通過逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)，產(chǎn)生嵌合抗原受體 (CAR)。轉(zhuǎn)導(dǎo)后，新設(shè)計的CAR-T細胞再離體擴增。下圖顯示了細胞活力和擴增的CAR-T細胞數(shù)量。

CAR-T細胞擴增后的細胞濃度和活力。CAR-T細胞樣本的原始圖像和標(biāo)記圖像（A、B、C）以及細胞濃度和活力（D、E）

5、CAR-T細胞產(chǎn)品

擴增的CAR-T細胞被冷凍保存并評估劑量。如圖顯示具有不同細胞活力的2個樣品的活力和濃度。

結(jié)論

從最初收集主要原材料到最終劑量確定，LUNA-FX7™滿足在整個CAR-T生產(chǎn)過程中監(jiān)測細胞健康和活力的需求。此外，結(jié)合預(yù)設(shè)的驗證載玻片、內(nèi)部QC軟件和可選的21 CFR Part 11合規(guī)軟件，可確保滿足和維持嚴格的QC和監(jiān)管指南。

點成生物細胞計數(shù)解決方案

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