轉染常見問題分析及解決方案

基因轉染是將具生物功能的核酸（RNA或DNA）轉移或運送到細胞內(nèi)，并使核酸在細胞內(nèi)維持其生物功能的核酸轉移技術。轉染技術的目的是主要是研究真核基因的表達和調(diào)控，目前的方法包括磷酸鈣共沉淀法，電穿孔法以及同DEAE-dextran或陽離子脂質(zhì)體試劑形成復合物法。在這些不同的方法中，DNA轉導的效率，轉導的機制，可重復性及使用的方便性都存在差異。而且，有效的DNA轉導會伴隨某些毒性或細胞抑制，其程度依賴于試劑、步驟和目的細胞的不同而不同，因此建議根據(jù)實際條件和實驗條件，選擇*佳的轉染方法。目前*常見的轉染方法有如下幾種：

　　磷酸鈣共沉淀

　　將氯化鈣，DNA和磷酸緩沖液混合，沉淀形成包含DNA且極小的不溶的磷酸鈣顆粒。磷酸鈣-DNA復合物粘附到細胞膜并通過胞飲進入目的細胞的細胞質(zhì)。沉淀物的大小和質(zhì)量對于磷酸鈣轉染的成功至關重要。在實驗中使用的每種試劑都必須小心校準，保證質(zhì)量，因為甚至偏離*優(yōu)條件十分之一個pH都會導致磷酸鈣轉染的失敗。

　　電穿孔法

　　電穿孔通過將細胞暴露在短暫的高場強電脈沖中轉導分子。將細胞懸浮液置于電場中會誘導沿細胞膜的電壓差異，據(jù)研究認為這種電壓差異會導致細胞膜暫時穿孔。電脈沖和場強的優(yōu)化對于成功的轉染非常重要，因為過高的場強和過長的電脈沖時間會不可逆地傷害細胞膜而裂解細胞。一般，成功的電穿孔過程都伴隨高水平（50%或更高）的毒性。

　　DEAE-葡聚糖和polybrene

　　帶正電的DEAE-葡聚糖或polybrene多聚體復合物和帶負電的DNA分子使得DNA可以結合在細胞表面。通過使用DMSO或甘油獲得的滲透休克將DNA復合體導入。兩種試劑都已成功用于轉染。DEAE-葡聚糖**于瞬時轉染。

　　機械法

　　轉染技術也包括使用機械的方法，比如顯微注射和基因槍（biolisticparticle）。顯微注射使用一根細針頭將DNA，RNA或蛋白直接轉入細胞質(zhì)或細胞核。基因槍使用高壓microprojectile將大分子導入細胞。

　　陽離子脂質(zhì)體試劑

　　將陽離子脂質(zhì)體試劑加入水中時，其可以形成微小的（平均大小約100-400nm）單層脂質(zhì)體。這些脂質(zhì)體帶正電，可以靠靜電作用結合到DNA的磷酸骨架上以及帶負電的細胞膜表面。使用陽離子脂質(zhì)體試劑，DNA并沒有預先包埋在脂質(zhì)體中，而是帶負電的DNA自動結合到帶正電的脂質(zhì)體上，形成DNA-陽離子脂質(zhì)體復合物。有研究報道，一個約5kb的質(zhì)粒會結合2-4個脂質(zhì)體。被俘獲的DNA就會被導入培養(yǎng)的細胞。目前對DNA轉導原理的證據(jù)主要來源于內(nèi)吞體和溶酶體的研究。

　　陽離子脂質(zhì)體介導的轉染法，由于轉染效率高，細胞毒性很低，操作簡便等特點，逐漸成為主要的轉染試劑。隨著基因表達和調(diào)控研究的深入，轉染技術成為研究中一種重要的實驗方法，從而推動了新一代轉染試劑的研發(fā)和利用。天為時代公司開發(fā)的TRANSfection和TRANSquick基因轉染試劑是*新一代的陽離子聚合物轉染試劑的代表，對多種細胞的轉染具有*高的轉染效率。